一、 甲基化DNA免疫共沉淀测序概述

甲基化DNA 免疫共沉淀测序（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing， MeDIP-Seq）先用5'-甲基胞嘧啶抗体富集胞嘧啶甲基化的基因组片断，然后对富集的片段进行高通量测序。该方法检测范围覆盖全基因组，所需测序数据量较少，但不能在单碱基分辨率水平上检测DNA胞嘧啶甲基化状态。

二、 甲基化DNA免疫共沉淀测序研究内容

• 全基因组不同水平甲基化区域的分布：分析MeDIP-Seq 读序在全基因组、不同功能元件区域（CpG 岛、重复序列、启动子、非翻译区、外显子、内含子和基因间等）的分布情况。识别序列富集峰（peak）。结果可显示不同样本间DNA甲基化修饰模式的差异。
• 基于富集峰的基因功能及其调控机制的预测：对于单个样本，分析与peak相关的基因；对于多样本，进行基于peak 的全基因组甲基化差异分析。通过分析差异甲基化区段（DMR），对差异基因进行GO功能富集分析及pathway功能分析；也可结合表达谱数据，预测受甲基化调控的基因。

研究流程示例

三、 甲基化DNA免疫共沉淀测序实验技术路线

MeDIP-Seq实验流程

四、 样品要求（基因组DNA）

样品纯度：OD 260/280值应在1.8～2.0 之间；RNA 应去除干净。
样品浓度：最低浓度不低于50ng/ul。
样品总量：每个样品总量不少于10ug。
样品溶剂：溶解在H20或TE (pH 8.0)中。
样品运输：DNA低温运输（-20℃）；且在运输过程中请用parafilm将管口密封好，以防出现污染。

五、 甲基化DNA免疫共沉淀测序数据分析流程

六、 MeDIP-Seq数据分析内容

1. 测序数据质量控制

包括：总reads数、总base数，Q20比例、Q20位点分布图。

2. 测序数据预处理

包括：去除总体质量偏低的reads，将质量大于20碱基所占比例小于50%的reads去除；去除3’端质量Q低于20的碱基；去除reads中所含有的接头序列；去除长度小于20的测序片段(reads)。

3. 将预处理后的reads比对到参考基因组并统计富集效率

包括：Reads唯一比对率，在CpG岛区域、启动子区域及整个基因组的覆盖及不同深度关系

4. 测序深度是否足够质量控制

5. 甲基化富集效果质量控制

 

6. Peak查找和统计

应用MACS软件对基因组mapping得到的bam文件进行peak 富集区查找，并统计长度和染色体分布。

7. Peak在CpG岛、不同基因功能元件中的分布

  

8. 基于peak的样本间差异分析

将各样本有重叠的peak合并，统计每个样本在合并后的peak中是否富集，统计组间差异的个数并基于RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads)计算peak在组间差异是否显著。

9. 样本间富集程度相关性分析

 
10. 样本间差异peak区域测序深度作图

 
11. 全基因组甲基化图谱

 对差异基因进行GO功能富集分析及pathway功能分析

12. 对差异基因进行GO功能富集分析及pathway功能分析

GO功能分析：

 
KEGG功能分析：

 

13. MeDIP-seq数据和表达谱数据结合分析

将MeDIP-seq数据和表达谱数据结合分析，对富集peak区域和差异表达基因进行关联，可进行差异基因的甲基化情况聚类热图、不同基因区域甲基化和表达谱相关性计算和作图。

14. 客户定制分析 

可根据客户的研究需求，协商定制个性化分析内容。

MeDIP-Sequencing应用案例

• PNAS：研究发现DNMT3A突变驱动了慢性粒单核细胞白血病

在20%的急性髓性白血病案例中会发生DNMT3A的突变，突变热点为Arg882 (R882)。本研究通过运用逆转病毒转导及骨髓移植（BMT）的方法来研究DNMT3A-Arg882His (R882H)突变体的转化能力。研究人员发现突变的基因能够引起造血干细胞/祖细胞的异常增殖。BMT 1年后，所有小鼠都出现了血小板增多，且患上CMML。RNA芯片分析结果显示一些造血作用相关基因异常表达，DNA甲基化实验证实基因区域甲基化类型发生相应的变化（课题相关MeDIP-SEQ技术服务由上海伯豪生物技术有限公司提供）。此外，DNMT3A-R882H增加了CDK1蛋白水平，加强了细胞周期活力，这些都导致白血病的生成。上海交通大学医学院附属瑞金医院的陈竺院士、陈赛娟院士以及王月英博士是这篇论文的共同通讯作者。 

原文：DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression/DNA methylation in hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Feb 4.

单位介绍

•        上海伯豪生物技术有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）是上海生物芯片有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心根据国内外研发外包发展的需要，整合旗下系统技术平台、商业化服务体系、高素质服务团队等资源成立的致力于研发外包服务的专业化公司。

  上海伯豪生物技术有限公司拥有六大服务平台：生物样品分析平台、微阵列芯片平台、新一代测序平台、生物标志物平台、分子检测平台、生物信息平台，凭借高标准的技术平台和多样化的服务等竞争优势，公司向国内外企业和相关单位提供系统的生物学研究全面解决方案。目前正在为多达18家跨国制药企业（包括排名前10位的跨国制药企业）和超过3000家的国内科研机构、医院等提供基因表达谱、基因分型、比较基因组学、DNA甲基化、miRNA、生物标志物筛选及确认、生物信息等技术服务。 

  公司拥有一支以上海为基础，辐射全国的强大市场营销队伍和销售网络，已设立华北、华南、华东三个大区十五个办事处，推广公司的主导技术服务、代理产品，快速提升公司品牌的知名度，扩大影响力。过去10年承接项目数超过10000个，用户单位3000家以上，协助客户发表SCI论文700余篇（影响因子共计3000多分），全面推动了中国基因组学服务产业的发展。 

  公司建立了规模化的质量控制体系，通过了ISO9001: 2008质量技术体系的认证，并参照GLP-L的标准，通过128个SOP文件对项目、样品、实验过程、生物信息分析过程、数据信息管理、保密等进行严格质控。尤其是数据管理，做到异地备份，保密管理。为用户的数据真实性、可靠性提供了保证。

  公司的系统化技术平台和高质量的服务体系得到了广大客户认可和合作伙伴的高度评价。公司平台陆续获得了国际知名高通量技术厂商Illumina、Affymetrix、Agilent、ABI的技术服务中心认证。公司于2012年获得诺华（CNIBR）优秀供应商奖（Supplier Award 2012）。公司是Affymetrix公司在中国第一家认证的服务提供商，是Agilent公司在国内唯一认证的服务提供商，先后被授予“Agilent公司亚太区最佳服务供应商”和“Affymetrix公司优秀服务商”称号。

  
  

单位资质

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